9. シグナルが弱い、またはシグナルがまったくありません。

9. シグナルが弱いか、またはシグナルがまったくありません。

考えられる原因 & 解決案
a.細胞または組織型は目的のタンパク質を発現しません。できれば標的タンパク質を発現することが既に確認された細胞または組織ライセートで陽性対照を行います。
b. 不適切な細胞処理。
適切な化学物質、タンパク質などで細胞を刺激します。刺激が働くことを確認します。
c.ゲルローディング用の不適切なサンプル調製
ライセート中のタンパク質が安定していることを確認してください。 適切なプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤などを使用してください。タンパク質サンプルにSDSが含まれていることを確認し、ゲルローディングの前に加熱されていることを確認してください。 ジチオスレイトール(DTT)および/または2-メルカプトエタノールなどの還元剤を含めます。
d.存在する抗原の量が不十分です。
ゲルにより多くのタンパク質をロードします。 また、特異的な抗原の濃度が低すぎる場合は、分画または免疫沈降によって抗原を濃縮してみてください。
e.タンパク質は膜に正しくトランスファーされていません。
使用前にPVDF膜をメタノール中に、またはニトロセルロースメンブレンをトランスファーバッファー中に濡らしてください。
メンブレンとゲルの間に良好な接触があることを確認します。
トランスファーの時間を最適化します。
トランスファーの後、分子量マーカーが確実にトランスファーされたことを確保します。Ponceau redでメンブレンを染色し、Coomassie blueでゲルを染色します。
f.メンブレンへの抗原の結合は不十分。
抗原が低分子量である場合、それは膜を通過するかもしれません。より小さな細孔サイズの膜または異なるタイプの膜に切り替えます。
g.抗原はブロッキング緩衝液に遮蔽されています。
牛乳、血清、BSA含有トリス緩衝生理食塩水、リン酸緩衝食塩水などの異なるブロッキングバッファーを試験します。それぞれの異なる濃度をテストします。
h.存在する抗体の量が不十分です。
一次および/または二次抗体の濃度を増加させます。
i.抗体の露光時間が短すぎます。
露光時間を増加させます。
j.抗体は活性を失っている可能性があります。
ドットブロット(Dot Blot)を行うことによって抗体を試験します。
k.膜の過度の洗浄。
洗浄の回数を減らします。
l.基質のインキューベーション時間は短すぎます。
基質のインキューベーション時間を増加させます。
m.基質が活性を失いました。
陽性対照を用いて基質を試験します。
n.アジ化ナトリウムは、HRP標識抗体の酵素反応を阻害しています。
アジ化ナトリウムをHRP標識抗体と共に使用しないでください。

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