8. 一つのウエスタンブロットにはバンドが多すぎます。

8. 一つのウエスタンブロットにはバンドが多すぎます。

A.抗原のタンパク質分解故障。 これは、特に試料が長期間保存された場合、または組織中のタンパク質または膜タンパク質が断片に切断される場合には、珍しいことではありません。全ての追加のバンドは全長タンパク質よりも分子量が低い。シナプシンおよびシナプトタグミンがとりわけ感受性です。 PMSF、ペプスタチンまたはロイペプチンのようなプロテアーゼ阻害剤を添加することを考えるべきです。
B. 各レーンのタンパク質が多すぎるか、または検出システムの感度が高すぎます。ゲルのオーバーローディングは「ゴーストバンド」(ghost bands)の最も一般的な原因です。固定されたタンパク質は特定のIgGが非特異的に結合し得る濃縮吸着表面を提供します。同様に、そのような非特異的結合は、高感度の検出システム、例えば、エンハンス化学発光を使用する場合には暴露されます。試験する試料に対する一連の希釈により、有効なシグナルであるバンドを判断するのに役立ちます。
C.非効率的なブロッキング。非イオン性界面活性剤および/またはタンパク質を含む様々な異なるブロッキング剤が文献に記載されています。ブロッキング条件の変更はこの問題を改善する可能性があります。
D.抗原の濃度が低すぎます。SDS-PAGEの解像度は50〜100バンドに制限されています。目的の抗原の相対濃度が低すぎる場合(総タンパク質の0.2%未満)、検出しにくいかもしれません。例えば、シナプトブレビン/ VAMPは、細胞ホモジネート中のヒストンと一緒に共遊走し、これはその検出を妨害します。シグナルのエンハンスメントは人為バンドの出現を引き起こす可能性があります。分画または免疫沈降による抗原の濃縮が考慮されるべきです。

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