2. シグナルが弱い、またはシグナルがまったくない原因は何ですか。

2. シグナルが弱いか、またはシグナルがまったくない原因は何ですか。

いくつかの 変数はこれを解釈できます。
a.これは、エレクトロブロッティング中のタンパク質の不十分な転写に起因する可能性があります。転写直後にIndia InkまたはPonceau-Sでメンブレンを染色してみてください。 これは、タンパク質転写の正確性を確認するための有効な方法であり、その後の実験にも干渉しません。これらの電気泳動および転写条件を最適化するには、推奨ウェスタンブロッティングプロトコールを参照してください。
b.検出酵素は不活性化になる可能性があります。アジ化ナトリウムは西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を不可逆的に不活性化するため、HRP標識試薬にアジ化ナトリウムがないように注意してください。 細菌汚染もHRP活性を低下させます。HRP標識は無菌状態に保ち、滅菌技術で取り扱い、推奨条件下で保存する必要があります。
c.特定のソースからのポリビニルラップ(polyvinyl wrap)がシグナルを消光することがあります。化学発光試薬でインキュベーションを繰り返し、2枚の書き込み可能な酢酸透明フィルムの間にブロットを置き、フィルムを露光することを提案します。
d.目的のタンパク質の発現レベルは非常に低いかもしれません。ウエスタンブロットの前に免疫沈降を行うことにより感度を上げることができます。
e. 非常に弱い抗原発現の場合に備えて、一次抗体インキュベーションのうちにTweenを排除することによって抗体結合を改善することが可能です。
f. Ag-Ab相互作用をより良く促進するために、一次抗体を37℃で穏やかにインキュベートしてから、さらに4℃で一晩インキュベートすることができます。

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