2.バックグラウンドが高いです (特異的または非特異的)。

免疫沈降または共免疫沈降中のいくつかの成分は、支持体の特異的または非特異的結合を引き起こし得る。特異的結合は、固定化分子が試料成分の標的と類似の配列またはドッキング部位を有する場合に生じる。非特異的結合は、電荷、疎水性表面の接触などに起因し得る。

以下は、非特異的結合の最も一般的な原因とその克服方法の要約である。

溶解工程

可能であれば、新鮮な材料を使用して、凍結細胞を避けるようにしてください。凍結した材料を使用する必要がある場合は、細胞の代わりに凍結した溶解液を使用してください。

結合工程:

抗体を切断することができるため、還元剤は使用しないでください。
生物学的液体をサンプルとして使用する場合(生物学的液体にはプロテインA、GまたはLに結合する抗体が含まれているかもしれない。当社の免疫磁気ビーズはプロテインA、GまたはLを使用しないが、磁気ビーズへの抗体の直接的固定化が必要である)

以下はあなたのためのいくつかのアドバイスです。
1.前述の「追加の注意事項、事前クリア」で説明したように、事前クリアリングステップを使用してください。

2.タンパク質凝集物を除去してください(100.000gで30分間回転する)。

3.一次抗体を使用する場合、インキュベーションステップを45分間に短縮してください。

4. プロテインA樹脂を使用する場合、インキュベーションステップを30分に短縮してください。

5.ブロックされたプロテインA-(またはプロテインG-)磁気ビーズは「追加の注意事項」の中のプロテインA / G / Lブロッキングを参照してください。

6.磁気ビーズは、細胞骨格(または他の糸状)タンパク質を有するIPに特に推奨される。なぜなら、これらのタンパク質は沈殿しやすい傾向があるからである。これまで従来のマトリックスでこれらの実験を首尾よく行うことが不可能であったが、二次抗体で被覆された磁気ビーズによりco-IPが可能になった。

洗浄工程:

アクチン汚染
1. 10 mM のATPを溶解液と洗浄緩衝液に添加する。
2.洗浄ストリンジェンシーとステップを調整する。
3.もっと高いストリンジェンシー緩衝液に移動し、洗浄ステップ数を増やす(上記の一般的なこつを参照)。
4終濃度1%のTween-20(ノニオン性洗剤)、終濃度0.2%SDS(陰イオン性で帯電した洗剤)、または終濃度1M NaClを使用してください。
5.蒸留水でこれらの高ストリンジェンシー洗浄の交替は、バックグラウンドまたは非特異的結合を減少させるのに役立ち得る。
6. 最後の洗浄ステップ後に汚染のキャリーオーバーを避けるためにマトリックスを新しいチューブに移してください。

溶出工程

溶出工程中にタンパク質を回収するために、典型的にはpH2.5〜3.0の緩衝液が使用される。Laemmli緩衝液中で免疫磁気ビーズを煮沸するこの代わり方案は、プロテインAまたはGおよび非固定抗体断片による試料の汚染を防ぐことができる。
界面活性剤または還元剤を用いた他の「温和な」溶出条件も同様に試験することができる。

検出工程:

ウェスタンブロットにおける高いバックグラウンドは、サンプルには抗体断片が多く存在する結果であり得る。サンプルの供給源に応じて、脂質、炭水化物または核酸による汚染はバックグラウンドを生成する可能性がある。この問題は、培養細胞溶解物を用いて作業する場合より、組織溶解物を用いて作業する場合にはるかに頻繁に生じる。

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免疫沈降 / IP トラブルシューティング
1. IP後はタンパク質が検出されなかった
2. バックグラウンドが高い (特異的または非特異的)
3. 抗体断片は目的のシグナルを遮断する
4. 最悪の場合: Co-IPは成功しない
免疫沈降 / IP FAQ