ウエスタンブロットFAQ

以下はウエスタンブロッティング(WB)におけるよくある質問です。 また、ウエスタンブロッティングに問題がある場合は、遠慮なく support@sinobiological.comまでお問い合わせください。

以下のページに速くアクセスします:
1 なぜ、anti-phosphorチロシン抗体を使う場合、バックグラウンドが高い、および/またはシグナルが減少するのでしょうか?
使用されるブロッキング溶液をチェックしてください。膜に結合するリン酸化タンパク質を有するPhosphotyrosineブロットを除いて、脱脂粉乳はすべてのブロットに適します。この試薬でブロッキングすることにより、潜在的なエピトープはブロットの全面に露出しています。この溶液中で抗Phosphotyrosine抗体を希釈すると、エピトープの多くをカバーし、検出に利用できる抗体が少なくなります。ブロッキング溶液としては「1% BSA含有TBS + Tween 20」をお勧めします。牛乳を使用しないでください。
2 時間が経つにつれて、ウェスタンブロットにおける抗体の活性が減少するのはなぜですか?
私たちの抗体をウェスタンブロット分析に使用していて、反応性が時間の経過とともに減少しているように見える場合は、考慮すべき点がいくつかあります。
考えられる原因 解決案
異なるサンプルを使用しました。 • 培養中の細胞は時間の経過とともに特性が変化するので、新鮮な細胞を解凍することを推奨します。
サンプルは保存中または繰り返し凍結融解の間に分解しました。 • 新鮮なサンプルを調製し、繰り返し凍結融解を避けてください。
抗体は汚染されていました。 • バイアルを遠心沈殿し、沈殿物を確認します。
二次抗体試薬は機能していません。 • 二次抗体試薬を変更してください。
非効率的なタンパク質転写。 • ゲルからブロットへのタンパク質の転写を確認するために、転写の後、India Inkでブロットを染色します。適切に保存した場合、抗体は非常に安定しており、時間が経つにつれて力価が低くなったり、消えたりする可能性が低いです。
3 不十分または不良な転写という問題はどのように克服するのですか。
タンパク質のサイズをチェックし、決定します。タンパク質が180 kDa以上の場合、下記の内容によって転写の条件を最適化 する必要があります。
• 20% MeOHを使用します。
• 0.05% SDSトランスファーバッファーを添加します。
• ライセートのローディング量を増加させます。
• 1 Aで1時間転写します。
4 「splotchy」または不均一なウエスタンブロットを避けるにはどうすればよいですか?
ウェスタンブロット分析を行う際に「splotchy」または不均一なブロットを避けるには:
• ブロッキング時間を延長することによって、ブロッキング効果を最適化します。
• 洗浄サイクルを延長します(これは組織ホモジネートサンプルにとって特に重要です)。
• ブロットに添加する前に、粉乳が完全に溶解していることを確認してください。
• タンパク質凝集を防ぐために、取り出す前に、抗体溶液を含むチューブを回転させてください。.
5 全ブロットに出現した斑状の、不均質なスポットはどのように避けますか?
全ブロットに出現した斑状の、不均質なスポットを避けるには:
• 細菌汚染に使用されているすべてのバッファーをチェックします。
• 抗体および洗浄インキュベーションの間、膜が完全に浸されたことを確保します。
• 転写を行う前、膜とゲルの間のすべての気泡を取り除きます。
• ロッカー/シェーカーで膜を置くことによって、ブロット全体への均一なアクセスを確保します。
• すべてのウェスタンブロッティング装置が適当に洗浄されたことを確認します。
• HRP複合体を濾過して、可能な凝集物を除去します。
• 基質の暴露時間を減少させます。
6 sinobiological WB抗体用の陽性対照ライセートとして何がありますか?
ウエスタンブロッティング抗体で最高のウエスタンブロット性能を得るために、テクニカルデータシートで推奨されている陽性対照ライセートをご使用ください。弊社が確立したプロトコールに正確に従うことで、陽性対照により、初期の実験で私たちが確立した結果を複製することができます。
長期間保存の場合、これらのライセートを-20℃で保存することを推奨します。ライセートは極めて安定です。なぜなら、それらはすべての酵素が変性で不活性化されている細胞調製物です。私たちはすでに広範な研究を行い、異なる条件下で安定性を確認しました。例えば、繰り返しの凍結融解サイクルの場合にしても、25℃で最大12週間保存した場合にしても、ほとんどのライセートの完全性および品質は影響を受けませんでした。しかしながら、ライセートは、37℃で保存した場合、4週間になると分解し始まります。ライセートのソースによっては安定性に多少のばらつきがあるので、-20℃で保存することを強く推奨します。
7 どのくらいのタンパク質を分析すべきですか?
推奨:
サンプルの種類 レーンあたり(per lane)
全細胞ライセート 50 μg
核抽出液 25 μg
8 このタンパク質を分離するために何パーセントのアクリルアミドゲルを使用すべきですか?
目的のタンパク質を最もよく分離するために、アクリルアミドゲルの割合は分子量に基づいて決定する必要があります。
タンパク質のサイズ(kDa) アクリルアミドゲルの割合(%)
<13 50
14-15 12
50 - 100 10
>100 8
9 どんな膜を使用すべきですか。
ニトロセルロースをお勧めします。 PVDFおよび他の似ている膜も使用することができるが、特にヤギポリクローナル調製物の場合、時にはバックグラウンドの増加を引き起こします。
10 どんなブロッキングバッファを使うべきですか?
1X TBS、5% 牛乳、0.05% Tween-20をお勧めします。ブロッキングは、室温で30〜60分間、または4℃で一晩行ってください。一晩インキュベートする場合は、Tweenをバッファーから除去する必要があります。
11 一次抗体はどれくらいの希釈率で使用すればいいですか?
個々の抗体のデータシートを確認してください。通常、開始希釈率が示されています。 データシートに特定の情報がない場合は、関連する陽性対照とネガティブコントロールに対して連続滴定を行うことをお勧めします。
12 実際のウエスタンブロットのバンドサイズが予測と異なるのはなぜですか?
ウェスタンブロッティングは、タンパク質をサイズによって分離する技術です。 一般に、タンパク質が小さければ小さいほど、SDS-pageゲルを介してより速く移動します。 しかし、移動速度は他の要因にも影響されるため、観察される実際のバンドサイズは予測と異なることがあります。
考えられる原因 説明
翻訳後修飾 リン酸化、グリコシル化などはタンパク質のサイズを増加させます。
翻訳後切断 大部分のタンパク質はプロタンパク質として合成され、次に切断されて活性型を与える。例えば、プロカスパーゼ。
スプライスバリアント 選択的スプライシングにより、同じ遺伝子から転写された異なるサイズのタンパク質が生成されます。これらのスプライスバリアントは、異なるサイズのタンパク質産物の生成をもたらします。スプライスバリアントの発現は、使用する特定の組織および実験条件によって非常に変わりやすいです。
アイソフォーム 多くのタンパク質は異なるサイズの複数のアイソフォームを発現します。同じ標的タンパク質の異なるアイソフォームの発現は使用する特定の組織および実験条件によって非常に変わりやすいです。いくつかのウェブサイトは特定標的のアイソフォームを決定するためにアクセスできます。
相対電荷 アミノ酸の組成(荷電vs非荷電)
多量体 例えば、タンパク質の二量体化。相互作用はもっと高いバンドの出現を引き起こすが、これは通常還元条件で阻止されます。
13 私のウエスタンブロット上のシグナルが弱いか、またはシグナルがまったくない原因は何ですか。
考えられる原因 説明
抗体滴定 最適なs/n比のための適切な抗体濃度を決定するために、滴定実験は複数の抗体濃度でテストする必要があります。一般的に、滴定範囲は0.2~5.0 ug/mlです。
組織/細胞特異性 標的タンパク質発現は検査される組織/細胞に依存している。使用されるシステムが標的タンパク質を検出するのに適していることを保証するために、文献検索を行うべきです。
再構成 抗体が適切に溶解することを確保にするために、凍結乾燥抗体を再懸濁する際には注意を払う必要があります。一般に、凍結乾燥した抗体ペレットはチューブの底にあるが、チューブ壁に粉末があることもあります。従って、抗体が完全に溶解することを確保するために、溶解はチューブの表面全体を覆うべきです。次いで、チューブを短時間遠心分離し、粉末全体がチューブの底に集まることを確保します。
陽性対照 ウエスタンブロットアッセイに陽性対照レーンを追加することは、抗体が適切に機能しているかどうか、および実験条件が適切かどうかを評価する最適な手段です。また、文献または内部実験結果に基づく陽性対照を用いて、抗体が適切に機能しているかどうかを評価することもできます。
14 この抗体は、異なる種の同じ標的と反応しますか。
主な種交差性:すべてのsinobiological抗体の主な種交差性はウエスタンブロット分析によって決定されます。これは主に、主な種由来の細胞株または組織で行われます。各抗体の主な種交差性および使用する検証組織はデータシートにリストされ、私たちのウェブサイトで見つけられます。
15 目的のタンパク質が180kD以上の場合、転写条件は変わるのですか?
• 各実験室は転写の条件/バッファーを最適化する必要があります。
• 20% MeOHを使用します。
• 0.05% SDSを添加します。
• 転写の時間と電源設定。1A、1時間を試しましょう。
• ライセート量の増加は、膜に転写されるコピー数の増加を引き起こします。