11. バックグラウンドが高い

11. バックグラウンドが高い

考えられる原因 &解決策
a.各レインのタンパク質が多すぎる。
各レインにロードされたタンパク質の量を減らす。
b.非特異的結合のブロッキングが不十分である。
ブロッキングの条件を調整する。
抗体バッファーにもブロッキング剤を入れてください。
c.一次抗体濃度が高すぎる可能性がある。
d.抗体を滴定し、 至適濃度を見つける。
e.二次抗体は非特異的に結合している可能性がある。二次抗体のみでブロットする。バンドが発生する場合は、他の二次抗体を選択してください。
f.インキュベーション温度が高すぎる可能性がある。 ブロットを4℃でインキュベートする。
g.ブロッキング剤と一次または二次抗体との交差反応。
Tween®-20のような温和な界面活性剤をリン酸化タンパク質特異的抗体のインキュベーション緩衝液および洗浄緩衝液に添加する。 ミルクの代わりにブロッキング試薬としてBSAを使用する。ミルクはカゼイン、リンタンパク質を含み、あなたの抗体はカゼインと交差反応している可能性がある。
h.結合していない抗体の洗浄が不十分である可能性がある。
洗浄回数を増やす。
i.メンブレンが高いバックグラウンドをもたらすことがある。
ニトロセルロース膜は、PVDFと比べより少ないバックグラウンドをもたらす。
j.膜は完全に乾燥である。
処理およびインキュベーションの間はメンブレンを乾燥させないように注意してください。

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