10. 非特異的なバンド

10. 非特異的なバンド

考えられる原因 &解決策
a. 非特異的な抗体バンド
一次抗体濃度を下げる。 
ゲルにロードされた総タンパク質量を減らす。
膜のブロッキング条件を調整する。
洗浄の回数を増加させる。
抗体の特異性を確認する。
二次抗体のみでブロットする。 バンドが発生する場合は、別の二次抗体を選択する
b. タンパク質の分解。
新鮮なサンプルを調製する。サンプル調製の間にプロテアーゼ阻害剤を使用する。サンプルの凍結/解凍サイクルを最小限に抑える。
c.分析物の凝集
ジスルフィド結合の完全な還元を確保するために、DTT(20-100mM)の量を増加させる。ゲルにロードする前に沸騰水浴中で5〜10分間加熱する。 
何回も継代された細胞株は、それらのタンパク質発現プロフィールにおいて差異を蓄積し得る。 最初の継代されていない細胞株に戻って、現在および最初の細胞株サンプルを並べて操作する。
タンパク質サンプルはアセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化などの複数のin vivo修飾を有する。修飾タンパク質変異体に関する文献を検討して、それに応じてサンプル調製を調整する。
標的タンパク質は複数のアイソフォームを有するか、または他のタンパク質は類似のエピトープを共有する。標的タンパク質アイソフォームに関する文献をチェックする。BLAST検索をして、交差反応の可能性を確認する。 他の細胞または組織のタイプを含める。

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