1.IP後はタンパク質が検出されませんでした。

ウェスタンブロットがうまく機能することを確認しましょう。適切な陽性対照および陰性対照を使用すべきです。陽性対照として全細胞溶解物または当社の陽性対照(KITでタグ付きタンパク質が提供される)を使用してください。次に、以下を確認しましょう。

溶解工程

4℃ですべてのステップを行い、タンパク質分解、脱リン酸化および変性を減らします。
これは、典型的には4℃で一晩(または少なくとも2時間)インキュベートする結合工程に特に重要です。
リンタンパク質を用いて作業する場合、ホスファターゼ阻害剤を添加する必要もあります。
上に述べたように、異なる溶解バッファーを試してみてください。ポジティブコントロールとして全細胞溶解液を使用し、タンパク質抽出が機能することを確認しましょう(膜タンパク質を扱う際に特に重要)。
least stringent溶解液で所望のタンパク質収率を得るのが「最適」だと考えられます。
co-IPの場合は、穏やかなボルテックスステップと広いピペットチップを使用してください。
タンパク質複合体を破壊しないように十分に注意してください。
さらに、タンパク質が相互作用するために添加物が必要な場合は、タンパク質複合体の捕捉を促進するためにこれらを結合緩衝液に含める必要があります。

結合工程:

抗体を切断することができるため、還元剤は避けてください。
ビーズに共有結合抗体を固定せずに「古典的な」IP法を使用してください。
固定化により、抗原に対する抗体の親和性を低下させ、IPを防止することができます。
これはポリクローナル抗体よりもモノクローナルで起こる可能性が高い。
抗体を直接に磁気ビーズへ固定することは、典型的には、抗体がプロテインAまたはGと架橋するよりも、抗体の機能的損失はより少ないが、依然として抗体がその抗原に結合する能力を低下させる可能性があります。

ここにあなたのためのいくつかのアドバイスがあります。
1.上記の追加の注意事項、Pre-clearingに記載されているPre-clearingのステップは避けてください。
2. 抗体および/または試料の量を増加させます(例えば、十分な量のタンパク質がビーズに接触するまで、溶解物アリコートを逐次インキュベートする)。
3.抗体の有効性を保つために、結合工程のインキュベーションは、典型的には4℃で2時間行います。
4.バックグラウンドの問題が発生する可能性が高いため、濃度が非常に高いサンプルは使用しないでください。
5.あなたの餌タンパク質を過剰発現させ、タンパク質が細胞内で適切に折り畳まれないように発現レベルが高くなく、アーティファクトまたは結合の喪失を招くことに注意してください。
6. 異なる結合条件を試してください。 上記の追加注意事項とIPバッファーを参照してください(例えば、異なる濃度の洗剤または異なる洗剤のバッファー、特に膜タンパク質を扱う場合)。
7. 追加の注意事項、インビボ架橋に記載されているように、in-vivo架橋(co-IPの場合にはタンパク質複合体を安定化させる)を試みる。

洗浄工程:

必要であれば less stringent洗浄液を使用してください。洗浄ステップ数を減らしてください。

溶出工程:

溶出をpHシフトで行った場合、SDSサンプルローディングバッファー中のビーズの沸騰によりタンパク質収量が高くなるかどうかを確認する必要もあります。しかし、抗体フラグメントが溶出液中に出現すると、バックグラウンドが上昇します。

検出工程:

次のいずれかのオプションを使用して感度を上げます。
タンパク質の代謝標識(例えば、放射性または重アミノ酸により - 後者はMSに基づく検出方法のみに使用できる)。

抗体
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免疫沈降 / IPの紹介
免疫沈降 / IPのプロトコール
免疫沈降 / IPのコツ
免疫沈降 / IP トラブルシューティング
1. IP後はタンパク質が検出されなかった
2. バックグラウンドが高い (特異的または非特異的)
3. 抗体断片は目的のシグナルを遮断する
4. 最悪の場合: Co-IPは成功しない
免疫沈降 / IP FAQ